【公開番号】特開２００７－２２８８５０（Ｐ２００７－２２８８５０Ａ）
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【発明の名称】遺伝子断片のクローニング方法
【国際特許分類】
C12N 15/09 (2006.01)
【ＦＩ】
C12N 15/00 ZNA A
【審査請求】未請求
【請求項の数】１７
【出願形態】ＯＬ
【全頁数】２０
【出願番号】特願２００６－５２９２１（Ｐ２００６－５２９２１）
【出願日】平成１８年２月２８日（２００６．２．２８）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１７年度、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「生分解・処理メカニズムの解析と制御技術の開発 土壌中難分解性物質等の生分解・処理技術の開発」委託研究、産業再生法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】
【識別番号】５９１００１９４９
【氏名又は名称】株式会社海洋バイオテクノロジー研究所
【住所又は居所】岩手県釜石市平田第３地割７５番１号
【代理人】
【識別番号】１０００９１０９６
【弁理士】
【氏名又は名称】平木 祐輔
【代理人】
【識別番号】１０００９６１８３
【弁理士】
【氏名又は名称】石井 貞次
【代理人】
【識別番号】１００１１８７７３
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 節
【発明者】
【氏名】内山 拓
【住所又は居所】千葉県木更津市貝渕３－４－６ 鎌田ハイツ貝渕Ｃ１０５
【発明者】
【氏名】渡辺 一哉
【住所又は居所】岩手県釜石市平田第３地割７５番１ 株式会社海洋バイオテクノロジー研究所内
【テーマコード（参考）】
4B024
【Ｆターム（参考）】
4B024 AA20 CA01 CA20 HA19
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【要約】
【課題】 遺伝子の全長配列又は近接する領域をクローニングするための簡便かつ高感度な方法の提供。
【解決手段】（ａ）DNAを断片化するステップ、（ｂ）断片化DNAを環状化するステップ、（ｃ）既知の塩基配列に基づいて設計した２つのプライマーのうち、３’側をフォワードプライマーとしてかつ５’側をリバースプライマーとして用いて上記環状化DNAを鋳型とした増幅反応を行い、上記既知の塩基配列に近接する領域を増幅するステップ、（ｄ）任意により、得られる増幅産物を回収するステップを含む、既知の塩基配列に近接する領域、又は既知の塩基配列と同一の若しくは相同性を有する領域をクローニングする方法。
【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ａ）DNAを断片化するステップ、
（ｂ）断片化DNAを環状化するステップ、
（ｃ）既知の塩基配列に基づいて設計した２つのプライマーのうち、３’側をフォワードプライマーとしてかつ５’側をリバースプライマーとして用いて上記環状化DNAを鋳型とした増幅反応を行い、上記既知の塩基配列に近接する領域を増幅するステップ、
（ｄ）任意により、得られる増幅産物を回収するステップ、
（ｅ）回収した増幅産物を増幅可能なプライマーを用いて該増幅産物を鋳型とした増幅反応を行うステップ、
を含む、既知の塩基配列に近接する領域、又は既知の塩基配列と同一の若しくは相同性を有する領域をクローニングする方法。
【請求項２】
以下のステップ：
（ａ）DNAを断片化するステップ、
（ｂ）断片化DNAを環状化するステップ、
（ｃ）既知の塩基配列に基づいて設計した２つのプライマーのうち、３’側をフォワードプライマーとしてかつ５’側をリバースプライマーとして用いて上記環状化DNAを鋳型とした増幅反応を行い、上記既知の塩基配列に近接する領域を増幅するステップ、
（ｄ）得られた増幅産物中の上記既知の塩基配列以外の領域に基づいて設計した１つのプライマーと上記既知の塩基配列に基づいて設計した１つのプライマーを用いて、上記DNAを鋳型とした増幅反応を行うステップ、
を含む、既知の塩基配列に近接する領域をクローニングする方法。
【請求項３】
DNAの断片化を制限酵素処理により行う、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
制限酵素が付着末端を生じる制限酵素である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
制限酵素がEcoR I、Xho I及びApaL Iからなる群より選択される、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
DNAがゲノムDNA、プラスミドDNA、及びファージDNAからなる群より選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
DNAが単一の生物に由来するものである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
DNAが複数の生物に由来するものである、請求項６記載の方法。
【請求項９】
DNAが、環境サンプル、発酵槽サンプル及び集積培養サンプルから抽出されたDNAである、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
断片化DNAの環状化がセルフライゲーションにより行われる、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
既知の塩基配列が、代謝系遺伝子、転写制御系遺伝子、又はトランスポゾンをコードするものである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
既知の塩基配列に近接する領域が未知の配列を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
プライマーのうち少なくとも１つがランダムプライマーである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）において使用するプライマーの一方又は両方が標識されたものである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
標識がビオチンである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｄ）において、標識を利用して増幅産物を回収する、請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｄ）において、ストレプトアビジンを固定化した磁気ビーズを用いて、ビオチン標識を有する増幅産物を回収する、請求項１５又は１６記載の方法。
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